Spectrophotometers telah menjadi alat rutin dalam makmal molekul moden. Selalunya digunakan untuk asid nukleik, kuantifikasi protein dan kuantifikasi kepekatan pertumbuhan bakteria.
Prinsip spektrofotometer mudah
Spektrofotometer menggunakan sumber cahaya yang boleh menjana pelbagai panjang gelombang, dan melalui satu siri alat spektroskopik untuk menghasilkan sumber cahaya pada panjang gelombang tertentu. Selepas sumber cahaya melewati sampel yang akan diuji, sebahagian daripada sumber cahaya diserap, dan penyerapan sampel dikira, dan seterusnya menjadi tumpuan sampel. . Penyerapan sampel adalah berkadar dengan kepekatan sampel.
Pengiraan asid nukleik
Pengkuantian asid nukleik adalah fungsi yang paling sering digunakan oleh spektrofotometer. Oligonukleotides, DNA tunggal terkandas, dua-stranded, dan RNA boleh diukur dalam penampan. Puncak penyerapan puncak tertinggi penyerapan asid nukleik ialah 260 nm. Komposisi molekul setiap asid nukleik adalah berbeza, jadi faktor penukaran berbeza. Untuk mengukur pelbagai jenis asid nukleik, pilih pekali yang sama terlebih dahulu. Sebagai contoh, penyerapan 1 OD bersamaan dengan 50 μg / ml dsDNA, 37 μg / ml ssDNA, 40 μg / ml RNA, dan 30 μg / ml Olig. Penyerapan selepas ujian ditukarkan oleh pekali di atas untuk mendapatkan kepekatan sampel yang sepadan. Sebelum ujian, pilih prosedur yang betul, masukkan isipadu penyelesaian stok dan pelarut, kemudian uji penyelesaian kosong dan sampel. Bagaimanapun, eksperimen itu tidak selalu lancar. Bacaan yang tidak stabil mungkin sakit kepala terbesar bagi penguji. Instrumen yang mempunyai sensitiviti yang lebih tinggi menunjukkan aliran yang lebih besar dalam penyerapan.
Malah, prinsip reka bentuk dan prinsip kerja spektrofotometer membolehkan penyerapan itu berubah mengikut jarak tertentu, iaitu instrumen mempunyai ketepatan dan ketepatan tertentu. Sebagai contoh, ketepatan Biophotometer Eppendorf ialah ≤1.0% (1A). Keputusan ujian berbilang itu bervariasi antara kira-kira 1.0% dari min dan normal. Di samping itu, perlu juga dipertimbangkan sifat-sifat fizikokimia asid nukleik itu sendiri dan pH buffer di mana asid nukleik dibubarkan, kepekatan ion, dan sebagainya. Apabila kepekatan ion terlalu tinggi semasa ujian, membaca syif, jadi disyorkan untuk menggunakan nilai pH tertentu dan kepekatan ion yang rendah. Buffers, seperti TE, sangat menstabilkan pembacaan. Kepekatan pencairan sampel juga merupakan faktor yang tidak boleh diabaikan: disebabkan oleh kehadiran yang tidak dapat dielakkan dari beberapa zarah halus, contohnya sampel asid nukleik, dalam sampel. Kehadiran zarah-zarah kecil ini mengganggu keputusan ujian. Untuk mengurangkan kesan zarah pada hasil ujian, penyerapan asid nukleik diperlukan sekurang-kurangnya lebih besar daripada 0.1 A, dan penyerapannya adalah lebih baik antara 0.1 dan 1.5 A. Dalam julat ini, gangguan terhadap zarah agak kecil dan hasilnya stabil.
Ini bermakna bahawa kepekatan sampel tidak boleh terlalu rendah atau terlalu tinggi (di luar julat ujian fotometer). Akhir sekali, faktor-faktor operasi, seperti pencampuran harus mencukupi, jika tidak, nilai penyerapan adalah terlalu rendah, bahkan nilai negatif; campuran tidak boleh wujud gelembung, cecair kosong tidak mempunyai masalah yang digantung, sebaliknya pembacaan melayang drastik; cuvette yang sama mesti digunakan untuk menguji kosong dan sampel Jika tidak, perbezaan kepekatan terlalu besar; faktor penukaran dan unit tumpuan sampel dipilih secara konsisten; kuadrat dengan memakai tetingkap tidak boleh digunakan; jumlah sampel mesti mencapai jumlah minimum yang diperlukan oleh cuvette.
Di samping kepekatan asid nukleik, spektrofotometer juga menunjukkan beberapa nisbah yang sangat penting yang menunjukkan kesucian sampel, seperti nisbah A 260 / A 280, yang digunakan untuk menilai kesucian sampel kerana puncak penyerapan protein adalah 280 nm. Satu sampel tulen dengan nisbah lebih besar daripada 1.8 (DNA) atau 2.0 (RNA). Jika nisbah lebih rendah daripada 1.8 atau 2.0, ia menunjukkan kehadiran protein atau bahan fenolik. A 230 menunjukkan beberapa bahan pencemar hadir dalam sampel, seperti karbohidrat, peptida, phenol, dan sebagainya, dan nisbah asid nukleik yang lebih bersih A 260 / A 230 lebih besar daripada 2.0. A 320 mengesan kekeruhan penyelesaian dan faktor gangguan lain. Untuk sampel tulen, A 320 secara amnya 0.
Hangzhou Sumer Instrument Co., Ltd
Tambah: No.168 Wuchang Ave., Daerah Yuhang, Hangzhou 310023, China
TEL: + 86-571-88739859
Telefon: +8618658504900
E-mel: info@sumerlab.com
Web: sumerinstrument.com