Pengenalan Kepada Prinsip Dan Aplikasi Komponen Umum Spectrophotometer

Spectrophotometer digunakan secara meluas dalam penyelidikan biologi, kimia, klinikal dan alam sekitar.
Spektrofotometri mengukur berapa banyak cahaya yang boleh diserap oleh kimia dengan menyampaikan pancaran cahaya menerusi sampel dalam spektrofotometer.
Dengan mengukur keamatan cahaya yang dikesan, kaedah ini boleh digunakan untuk menentukan kepekatan larut dalam sampel.
Konsep Spektrofotometri
Rasuk yang dihantar ke sampel terdiri daripada rasuk foton.
Apabila foton memenuhi molekul dalam sampel, molekul dapat menyerap beberapa daripada mereka, mengurangkan jumlah foton dalam rasuk dan mengurangkan intensiti isyarat pengesanan.
Transmisi adalah sebahagian daripada cahaya melalui sampel. Ia ditakrifkan sebagai keamatan cahaya melalui sampel pada intensiti cahaya insiden.
Penyerapan adalah bertentangan dengan transmisi, bersamaan dengan jumlah yang diukur oleh spektrofotometer.
Menurut penyerapan, kepekatan sampel penyelesaian boleh ditentukan dari undang-undang Lambert undang-undang, yang menunjukkan bahawa terdapat hubungan linear antara penyerapan dan kepekatan sampel. Menurut undang-undang Lambert bir, penyerapan adalah produk pekali penyerapan, yang merupakan ukuran jumlah cahaya yang diserap oleh larut pada jarak gelombang tertentu dan jarak melalui cahaya yang berlalu. Sampel, atau jarak perjalanan, dan kepekatan larut. Secara umum, matlamat mengukur penyerapan adalah untuk mengukur kepekatan sampel.
Komponen spektrofotometer
Setiap spektrofotometer terdiri daripada sumber cahaya, kolimator (kanta atau alat yang memfokus untuk memancarkan rasuk yang kuat dan lurus), monokromator untuk memisahkan rasuk panjang gelombang yang berbeza, dan pemilih panjang untuk memilih gelombang atau alur panjang gelombang yang dikehendaki. Panjang gelombang cahaya yang digunakan dalam spektrofotometer yang dibentangkan dalam video ini adalah dalam pelbagai ultraviolet dan cahaya yang boleh dilihat. Spektrofotometer juga termasuk pemegang sampel, photodetector dan skrin yang memaparkan hasil pengesan.
Spektrofotometer paling terkini disambungkan terus ke komputer, di mana parameter eksperimen dapat dikawal dan hasilnya dipaparkan.
Prinsip kerja spektrofotometer
Apabila menjalankan spektrofotometri, adalah penting untuk mengambil langkah berjaga-jaga yang sesuai, seperti memakai sarung tangan, bergantung pada jenis penyelesaian biologi atau kimia yang anda gunakan.
Hidupkan peranti dan biarkan lampu dan elektronik menjadi panas sebelum mengukur spektrum UV-Vis sampel.
Sediakan sampel kosong penyelesaian yang sama dengan pH yang sama dan kekuatan ionik yang sama, tetapi tanpa komponen yang akan dianalisis; kerana cuvette dan pelarut boleh menyuraikan cahaya, adalah perlu untuk menganalisis sampel.
Pemegang sampel spektrofotometer tradisional direka untuk memegang mangkuk plastik dan kuarza. Putar penyelesaian asal ke dalam mangkuk.
Selepas menghapuskan cap jari dan percikkannya di luar mangkuk, masukkan cuvette dengan betul ke dalam pemegang sampel dan tutup pintu penutup.
Jangan lupa menutup pintu kerana sinaran UV dari spektrofotometer terbuka boleh merosakkan mata dan kulit anda.
Program panjang gelombang atau panjang gelombang yang dikehendaki yang akan dihantar ke sampel. Ini bergantung kepada panjang gelombang terbaik yang komponen yang dianalisis dapat diserap. Mesin itu kemudiannya dilepaskan dengan mengukur sampel kosong, yang mengurangkan penyerapan bawah kerana penampan sampel.
Bergantung kepada jenis percubaan spektrofotometri yang anda lakukan, mungkin diperlukan untuk menghasilkan lengkung standard sebelum pengukuran sampel, dari mana kepekatan kompaun yang dianalisis dalam sampel boleh ditentukan.
Benarkan sampel untuk mencapai suhu yang betul dan campurkan dengan lembut untuk mengelakkan memperkenalkan gelembung. Sampel kemudian boleh ditambah terus ke dalam mangkuk di dalam mesin dan bacaan boleh dibuat.
Selepas sampel telah diukur untuk penyerapan, eksperimen dikira dengan betul; contohnya, untuk menentukan tahap kepekatan atau enzim aktiviti.
Penggunaan spektrofotometer
Salah satu kegunaan spektrofotometer adalah untuk mengukur ketumpatan sel. Pengukuran ketumpatan sel boleh digunakan untuk menghasilkan lengkung pertumbuhan logaritma bakteria, dari mana masa optimum untuk integrasi protein rekombinan dapat ditentukan.
Spektrofotometer juga boleh digunakan untuk mengukur kadar reaksi kimia. Dalam perwujudan ini, penyerapan digunakan untuk memantau reaksi enzimatik, yang hilang dengan masa melalui tindak balas perantaraan 452nm. Kadar langkah enzim ini boleh dikira dengan memadankan data dengan persamaan yang sesuai.
Pengenalan spektrofotometer mikro menghilangkan keperluan pemegang sampel. Spektrofotometer ini menggunakan ketegangan permukaan untuk mengekalkan sampel.
Microspectrophotometer adalah pilihan terbaik untuk mengukur jisim dan kepekatan sampel kecil dan mahal, seperti biomolekul, termasuk protein dan asid nukleik.
Penyerapan protein pada 280nm bergantung kepada kandungan rantai sampingan aromatik yang terdapat di tryptophan, tirosin dan fenilalanin, serta ikatan disulfida antara kedua-dua sista.
Kepekatan protein boleh ditentukan oleh penyerapannya pada 280nm dan pekali penyerapannya, yang berdasarkan komposisi asid amino.
DNA dan RNA mempunyai penyerapan maksimum pada 260nm, dari mana kepekatan mereka boleh ditentukan. Keaslian asid nukleik juga boleh dinilai dari nisbah bacaan penyerapan kepada panjang gelombang tertentu.