Kuantifikasi protein warna kolum spektrofotometrik
Protein biasanya campuran protein. Pemeriksaan Colorimetric adalah berdasarkan kepada unsur-unsur protein: Asid amino (contohnya tyrosine, serine) bertindak balas dengan kumpulan kromogenik tambahan atau pewarna untuk menghasilkan bahan berwarna. Kepekatan bahan berwarna secara langsung berkaitan dengan jumlah asid amino protein yang bertindak balas, dengan itu mencerminkan kepekatan protein.
Kaedah colorimetric
Terdapat beberapa kaedah seperti BCA, Bradford, dan Lowry.
Kaedah Lowry: Berdasarkan reaksi Biuret terawal dan bertambah baik. Protein bertindak balas dengan Cu2 untuk menghasilkan reaksi biru. Walau bagaimanapun, kaedah Lowry lebih sensitif daripada Biuret. Kelemahannya ialah keperluan untuk secara beransur-ansur menambah beberapa reagen yang berbeza; tindak balas mengambil masa yang lama; mudah terdedah kepada bahan bukan protein; protein yang mengandungi EDTA, Triton x-100, dan ammonia sulfate tidak sesuai untuk kaedah ini.
Ujian asid Bicinchoniinine: Ini adalah sejenis assay protein yang lebih baru. Protein untuk dianalisis bereaksi dengan Cu2 dalam larutan alkali untuk menghasilkan Cu, yang membentuk chelate dengan BCA untuk membentuk sebatian ungu dengan puncak penyerapan pada 562 nm. Hubungan linear antara kepekatan sebatian ini dan protein adalah kuat, dan sebatian yang terbentuk selepas reaksi sangat stabil. Berkenaan dengan kaedah Lowry, operasi ini mudah dan kepekaannya tinggi. Walau bagaimanapun, sama dengan kaedah Lowry, ia mudah terdedah kepada protein dan detergen.
Kaedah Bradford: Prinsip kaedah ini ialah protein bertindak balas dengan Coomassie Brilliant Blue untuk menghasilkan sebatian berwarna yang menyerap pada 595 nm. Ciri utamanya adalah kepekaannya, iaitu 2 kali dari Lowry dan BCA. Lebih mudah dan cepat. Ia hanya memerlukan satu jenis reagen reaksi. Kompaun ini boleh stabil selama 1 jam untuk memudahkan hasilnya; Bergantang dengan Lowry, BCA bereaksi dengan mengurangkan agen (misalnya DTT, mercaptoethanol) yang serasi. Walau bagaimanapun, ia masih sensitif terhadap detergen. Kelemahan utama adalah bahawa piawaian yang berbeza boleh membawa kepada perbezaan yang besar dalam hasil sampel yang sama dan tidak ada hasil yang boleh dibandingkan.
Sesetengah penyelidik yang terdedah kepada ukuran kolima untuk kali pertama boleh dikelirukan oleh keputusan pelbagai ujian warna. Apakah jenis kaedah yang anda percaya keliru? Oleh kerana kumpulan-kumpulan itu bertindak balas dengan cara yang berbeza dan kumpulan kromogen tidak sama, beberapa kaedah digunakan serentak untuk membuat kepekatan sampel sampel yang sama tidak konsisten. Sebagai contoh, Keller et al. menguji protein dalam susu manusia dan mendapati kepekatan yang diukur oleh Lowry dan BCA jauh lebih tinggi daripada Bradford. Perbezaannya adalah penting. Walaupun sampel yang sama ditentukan, sampel standard yang dipilih dengan kaedah kolimetri yang sama tidak konsisten, dan kepekatan selepas ujian juga tidak konsisten. Sebagai contoh, gunakan Lowry untuk menguji protein dalam homogenat sel, menggunakan BSA sebagai standard, dengan kepekatan 1.34 mg / ml, dan globulin sebagai standard dengan kepekatan 2.64 mg / ml. Oleh itu, sebelum memilih kaedah colorimetric, lebih baik merujuk kepada komposisi kimia sampel yang akan diuji, dan mencari protein standard yang serupa dengan kimia sebagai standard. Di samping itu, kaedah kolumimetrik untuk menilai protein sering menyebabkan masalah kerana nilai penyerapan sampel terlalu rendah, menyebabkan perbezaan besar antara kepekatan sampel diukur dan kepekatan sebenar. Isu utama adalah bahawa warna bahagian penting dari spektrofotometer 1011, cuvette, mempunyai separuh hayat tertentu, sehingga setiap kaedah colorimetrik menyenaraikan masa ujian reaksi. Semua sampel (termasuk sampel standard) mesti diuji dalam masa ini. Jika masa terlalu panjang, nilai penyerapan yang diperoleh menjadi lebih kecil dan nilai kepekatan yang ditukar telah berkurangan. Di samping itu, suhu tindak balas, nilai pH penyelesaian, dan sebagainya adalah semua faktor penting yang mempengaruhi eksperimen. Di samping itu, sangat penting untuk menggunakan colorimetri plastik. Elakkan penggunaan cuvet yang diperbuat daripada kuarza atau kaca kerana warna selepas tindak balas akan menyebabkan kuarza atau kaca berwarna, menghasilkan penyerapan sampel yang tidak tepat.
Syarikat ini mengkhususkan diri dalam penjualan spektrofotometer , pelanggan yang dialu-alukan yang mempunyai keperluan untuk berunding dan membeli, kami akan menyediakan anda dengan perkhidmatan yang ikhlas dan produk yang berkualiti, serta harga yang lebih rendah.
E-mel: info@sumerlab.com
Web: sumerinstrument.com